MIT 方法使數以千萬計的密集細胞實現超快速蛋白標記 | MIT 新聞

麻省理工學院 (MIT) 開發出一項新技術，使科學家能夠以空前的速度、均勻性和多樣性標記數百萬個獨立細胞中的蛋白質，並且在完整的三維組織中進行。利用這項技術，研究團隊能在一天內對大型組織樣本進行豐富的標記。在他們的新研究中，發表在《自然生物技術》 (Nature Biotechnology) 上，他們還展示了在大型組織樣本中以單細胞水平標記蛋白質的能力，可以揭示其他常用標記方法所隱藏的見解。

分析細胞所製造的蛋白質是生物學、神經科學和相關領域研究的基礎，因為細胞在特定時刻表達的蛋白質可以反映出細胞正在執行的功能或對環境（例如疾病或治療）的反應。儘管顯微鏡和標記技術已經取得了很大進展，促成了無數的發現，但科學家們仍然缺乏一種可靠且實用的方法來追蹤整個三維完整組織中數百萬個密集細胞的蛋白質表達。通常，科學家只能在薄的組織切片下進行研究，因此無法充分理解細胞在整個連接系統中的蛋白質表達。

研究的資深作者之一、麻省理工學院 (MIT) 皮考爾學習與記憶研究所 (The Picower Institute for Learning and Memory) 的副教授鄭光勳 (Kwanghun Chung) 說：「傳統上，研究細胞內的分子需要將組織分離成單個細胞或切成薄片，因為分析所需的光和化學物質無法深入組織。我們的實驗室開發了 CLARITY 和 SHIELD 等技術，使整個器官變得透明，但我們現在需要一種化學標記整個器官的方法，以獲得有用的科學見解。」「如果組織中的細胞處理不均勻，就無法進行定量比較。在傳統的蛋白質標記中，這些分子需要幾週的時間才能擴散到完整的器官中，這使得對器官規模組織的均勻化學處理幾乎不可能且極其緩慢。」

這種新方法稱為「CuRVE」，是朝著這一目標邁出的重大進展，經過多年的努力，展示了一種根本新的方法來均勻處理大型和密集的組織。在研究中，研究人員解釋了他們如何通過名為「eFLASH」的 CuRVE 實現克服技術障礙，並提供了大量生動的技術演示，包括如何產生新的神經科學見解。

共同第一作者、麻省理工學院 (MIT) 的研究生尹大熙 (Dae Hee Yun) 說：「這是一個重要的飛躍，特別是在技術的實際性能方面。」尹現在是 Chung 創立的初創公司 LifeCanvas Technologies 的高級應用工程師。論文的另一位共同第一作者是朴永均 (Young-Gyun Park)，他是前麻省理工學院 (MIT) 的博士後研究員，現在是南韓 KAIST 的助理教授。

聰明的化學

大型三維組織樣本難以均勻標記的根本原因是抗體滲透組織的速度非常慢，但它們與目標蛋白質結合的速度卻很快。這種速度不匹配的實際影響是，僅僅將大腦浸泡在抗體溶液中會導致組織外圍的蛋白質標記非常清晰，但幾乎沒有抗體能夠找到更深層的細胞和蛋白質。

為了改善標記，團隊設想了一種方法——CuRVE 的概念本質——來解決速度不匹配的問題。策略是持續控制抗體結合的速度，同時加快抗體在組織中的滲透速度。為了弄清楚這是如何工作的並優化這一方法，他們建立並運行了一個複雜的計算模擬，讓他們能夠測試不同的設置和參數，包括不同的結合速率和組織密度及成分。

然後，他們開始在真實組織中實施他們的方法。他們的起點是之前的一項技術，稱為「SWITCH」，在這項技術中，Chung 的實驗室設計了一種暫時關閉抗體結合的方法，讓抗體滲透組織，然後再重新開啟結合。儘管這種方法效果很好，但尹表示，團隊意識到如果能持續控制抗體結合速度，將會有顯著的改進，但 SWITCH 中使用的化學物質對這種持續處理來說過於苛刻。因此，團隊篩選了一系列類似的化學物質，以找到一種能更微妙和持續地調節抗體結合速度的化學物質。他們發現去氧膽酸是一個理想的候選者。利用這種化學物質，團隊不僅可以通過改變化學物質的濃度來調節抗體結合，還可以通過改變標記浴的 pH 值（或酸度）來調節。

同時，為了加快抗體在組織中的運動，團隊使用了 Chung 實驗室發明的另一項技術：隨機電輸送 (stochastic electrotransport)。這項技術通過施加電場來加速抗體在組織中的擴散。

將這種加速擴散的 eFLASH 系統與持續可調的結合速度相結合，產生了論文中展示的各種標記成功案例。總的來說，團隊報告使用了超過 60 種不同的抗體來標記大型組織樣本中的細胞蛋白質。

值得注意的是，這些樣本中的每一個都在一天內完成標記，這對於完整的器官來說是「超快速」的速度，作者們表示。此外，不同的準備不需要新的優化步驟。

有價值的可視化

團隊測試 eFLASH 的方法之一是將他們的標記與另一種常用方法進行比較：基因工程細胞，使其在轉錄特定蛋白質基因時發出螢光。基因方法不需要將抗體擴散到組織中，但可能會出現不一致，因為報告基因轉錄和實際蛋白質生產並不完全相同。尹補充說，雖然抗體標記可靠且立即報告目標蛋白質的存在，但基因方法可能不那麼即時和持久，即使當實際蛋白質不再存在時仍會發光。

在這項研究中，團隊同時在樣本中使用了這兩種標記。通過這種方式可視化標記，他們發現抗體標記和基因標記之間存在許多差異。在某些小鼠大腦區域，他們發現根據抗體標記，三分之二表達 PV（在某些抑制性神經元中突出的蛋白質）的神經元並未顯示任何基因基礎的螢光。在另一個例子中，只有一小部分細胞通過基因方法報告表達一種名為 ChAT 的蛋白質，並且同時通過抗體標記報告。換句話說，有些情況下，基因標記相比抗體標記嚴重低估或高估了蛋白質表達。

研究人員並不是要貶低基因報告方法的明顯價值，而是建議使用 eFLASH 允許的全器官抗體標記可以幫助將數據放在更豐富、更完整的背景中。「我們發現健康成年小鼠中 PV 免疫反應神經元的區域性大幅減少，並且個體變異性高，強調了全面和無偏見表型的重要性。」作者們寫道。

或者如尹所說，這兩種不同的標記方法是「兩種不同的工具，適合不同的工作。」

除了尹、朴和鄭，論文的其他作者還包括趙在勳 (Jae Hun Cho)、李凱門斯基 (Lee Kamentsky)、尼古拉斯·埃文斯 (Nicholas Evans)、尼古拉斯·迪納波利 (Nicholas DiNapoli)、凱瑟琳·謝 (Katherine Xie)、崔瑞宇 (Seo Woo Choi)、亞歷山大·阿爾巴內斯 (Alexandre Albanese)、田宇軒 (Yuxuan Tian)、孫昌浩 (Chang Ho Sohn)、張強歌 (Qiangge Zhang)、金閔瑤 (Minyoung Kim)、賈斯廷·斯瓦尼 (Justin Swaney)、韋伯斯特·關 (Webster Guan)、朴周赫 (Juhyuk Park)、蓋比·德拉蒙德 (Gabi Drummond)、崔希珍 (Heejin Choi)、盧茲達里·魯埃拉斯 (Luzdary Ruelas) 和馮國平 (Guoping Feng)。

這項研究的資金來自巴羅克威爾基金會 (Burroughs Wellcome Fund)、西爾獎學金計畫 (Searle Scholars Program)、帕卡德科學與工程獎 (Packard Award in Science and Engineering)、NARSAD 年輕研究者獎、麥克奈特基金會 (McKnight Foundation)、自由共同基金會 (Freedom Together Foundation)、皮考爾學習與記憶研究所 (The Picower Institute for Learning and Memory)、NCSOFT 文化基金會 (NCSOFT Cultural Foundation) 和國家衛生研究院 (National Institutes of Health)。